Funktionelle Charakterisierung einer Matrix Metalloproteinase aus Tomate

Matrix Metalloproteinasen (MMPs) steuern in zoologischen Systemen zahlreiche physiologische Prozesse, wie Embryogenese, Organogenese, Wundheilung, Zellteilung und – differenzierung. Ihre Fehlregulation führt zur Entstehung bedeutender Krankheiten wie z.B. Arteriosklerose und Krebs. In Pflanzen hingegen ist die Funktion der Enzyme erst ansatzweise verstanden bzw. in Tomatenpflanzen noch ungeklärt. Die biochemischen Eigenschaften der MMP1 aus Tomate (SlMMP1) wie auch der jüngst identifizierten SlMMP2 sind bekannt und deuten auf eine redundante Funktion der beiden Proteine in vivo hin. Die Aufklärung dieser Funktion stand im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. Für SlMMP1 und 2 wird die Verankerung in der Plasmamembran über einen Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Anker prognostiziert. In SlMMP1 überexprimierenden Zellkulturen und transgenen Pflanzen konnte eine Assoziation mit Membranpräparationen bestätigt werden. Für ein SlMMP1-GFP-Fusionsprotein wurde die Lokalisation in der Plasmamembran gezeigt. Die GPI-Verankerung konnte nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden, jedoch wurde eine für diese Verankerung typische Abspaltung von der Membran („shedding“) beobachtet. Wesentlich für die physiologische Aufgabe sind die Substrate von Proteasen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eines der in vivo-Substrate von SlMMP1/2 identifiziert werden. Dabei handelt es sich um die extrazelluläre Subtilase P69B aus Tomate, die von beiden MMPs in vitro gespalten wird. In transgenen Pflanzen, die die MMPs aufgrund von RNA-Interferenz nicht exprimieren (RNAi-Pflanzen), kommt es zu einer massiven Akkumulation von P69B. Die RNAi-Pflanzen zeigen einen auffälligen Phänotyp, welcher sich in nekrotischen Läsionen v.a. an Hypokotylen äußert, doch können Zelltodereignisse darüber hinaus auch im Rest der Pflanzen beobachtet werden. Die transiente Expression von P69B in Blättern von Tomaten- und Tabakpflanzen bestätigte die Beteiligung der Subtilase am kontrollierten Zelltod. Die Beobachtungen deuten darauf hin, dass SlMMP1 und 2 indirekt über die Spaltung von P69B eine Kontrolle über den Zelltod ausüben. Dies steht auch im Einklang mit der für P69B beschriebenen Rolle in der Pathogenabwehr. Bestätigung fanden diese Befunde durch die Analyse der Proteome von Wildtyp- und MMPRNAi- Pflanzen über 2D-DIGE. In RNAi-Pflanzen konnte die Anreicherung von P69B nachgewiesen werden. Darüber hinaus erwiesen sich zahlreiche an der Stressantwort beteiligte Proteine als signifikant hochreguliert. Hierbei handelte es sich um „klassische“ PR- Proteine, Endochitinasen, Peroxidase und weitere. Auffällig war weiterhin die an der Ethylen- Biosynthese beteiligte Methionin-Synthase. Das angesprochene Phytohormon spielt eine entscheidende Rolle in Stressreaktionen; seine deutlich erhöhte Biosynthese in MMP-RNAi- Pflanzen konnte bereits nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass es sich bei Matrix Metalloproteinasen in Tomaten um entscheidende Faktoren bei der Reaktion auf Pathogene sowie der Organisation des Apoplasten handelt. Neben dem Phänotyp der RNAi-Pflanzen bieten die hier vorgestellten Ergebnisse proteomischer Analysen hervorragende Ansatzpunkte für eine nähere Charakterisierung der Proteinfamilie.